北理工課題組在蛋白自組裝領(lǐng)域重要研究進(jìn)展
發(fā)布日期：2023-08-08 供稿：生命學(xué)院 攝影：生命學(xué)院
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近日，北京理工大學(xué)霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)在蛋白自組裝領(lǐng)域發(fā)表重要綜述（https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2023.06.009）,，發(fā)表在《Trends in Biotechnology》（影響因子：17.2996）,。該工作以北京理工大學(xué)為第一通訊單位,，副研究員陳振婭為第一作者，霍毅欣教授為通訊作者,，博士生毋彤,、于盛竹，碩士生李敏,、樊泫何為參與作者,。
酶自組裝是指目標(biāo)酶可在蛋白自組裝支架的輔助下聚集形成有序的大分子技術(shù)（圖1）。在代謝工程中,，自組裝策略已被用于聚集同一途徑中多個(gè)酶,，以提升多個(gè)酶的順序催化效率，進(jìn)而提升整條途徑的代謝通量,，增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物合成效率,，實(shí)現(xiàn)高水平生產(chǎn)。蛋白自組裝支架的性能對(duì)高效穩(wěn)定的多酶組裝系統(tǒng)的構(gòu)建至關(guān)重要,。本文首先分析了代謝工程現(xiàn)階段生產(chǎn)遇到的難題,，隨后闡述了自組裝支架在解決代謝工程難題中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。隨后,，將現(xiàn)有代謝工程領(lǐng)域應(yīng)用的蛋白自組裝支架進(jìn)行了分類,，并對(duì)不同支架的組裝方式進(jìn)行了綜合分析。接著,，闡述了自組裝支架在代謝工程領(lǐng)域不同模塊的應(yīng)用場(chǎng)景,，包括提高單個(gè)酶的催化效率，提升多酶級(jí)聯(lián)的順序催化效率,，減少副反應(yīng)及加強(qiáng)輔因子的供應(yīng)等,。此外，本文分析了現(xiàn)有自組裝支架的不足,，闡述了不同支架的組裝性能,，提出了針對(duì)不同支架的性能改進(jìn)策略，為高效微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供了新思路,。
圖1 酶自組裝及自組裝介導(dǎo)的代謝工程生產(chǎn)
上述綜述是對(duì)本團(tuán)隊(duì)近年來利用蛋白自組裝支架在代謝流調(diào)控方面的開發(fā)及應(yīng)用的總結(jié)和分析,，相關(guān)工作如下：
1. 利用自組裝支架構(gòu)建新型蛋白固定化方法
體外生物合成因其過程可控及轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)已經(jīng)成為生產(chǎn)高值化合物的一種極具吸引力的方法。體外生物合成過程中,，酶的可重復(fù)利用對(duì)于節(jié)省成本和提高合成效率至關(guān)重要,。酶固定化是實(shí)現(xiàn)酶重復(fù)利用的簡(jiǎn)單直接方法。簡(jiǎn)便易行的酶固定化方法可快速高效實(shí)現(xiàn)酶的固定化,?；诖耍暾?qǐng)人以食品生產(chǎn)香料的重要前體物異丁醛體外生物合成為例,，利用CipA的自組裝特性建立了一步自組裝的固定化策略,，利用此策略實(shí)現(xiàn)了纈氨酸到異丁醛合成途徑相關(guān)酶LeuDH和KivD的固定化,。結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果表明，CipA介導(dǎo)的酶固定化不影響目標(biāo)酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制（圖2）,。與游離酶相比,，固定化酶具有更高的轉(zhuǎn)化能力和熱穩(wěn)定性。此外,，批次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明,，使用多輪后回收的固定化酶具有與第一輪反應(yīng)中固定化酶相近的轉(zhuǎn)化能力。隨后,，通過搭建連續(xù)生產(chǎn)裝置,，同時(shí)將固定化酶裝載到連續(xù)生產(chǎn)裝置中，實(shí)現(xiàn)了異丁醛的體外連續(xù)生產(chǎn),。此項(xiàng)工作不僅拓展了自組裝系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,，而且為體外生產(chǎn)高值化合物提供了指導(dǎo)。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry （影響因子：6.1004）雜志上（In vitro biosynthesis of isobutyraldehyde through the establishment of a one-step self-assembly-based immobilization strategy.）,。副研究員陳振婭與碩士生趙璐瑤為共同第一作者,，霍毅欣教授與陳振婭副研究員為共同通訊作者。
圖2 CipA-KivD-LeuDH與底物的復(fù)合物模型
2. 利用自組裝支架重導(dǎo)細(xì)胞代謝流
鄰苯三酚是一種具有多種生理功能和藥物價(jià)值的酚類化合物,。申請(qǐng)人在大腸桿菌中成功構(gòu)建了以葡萄糖為初始碳源的鄰苯三酚非天然生物合成途徑,。在生物合成過程中，關(guān)鍵前體物4-羥基苯甲酸先被Y385F/T294A PobA催化生成3,4-二羥基苯甲酸,，3,4-二羥基苯甲酸再被Y385F/T294A PobA進(jìn)一步催化生成沒食子酸,，隨后脫羧酶PDC對(duì)沒食子酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)生成鄰苯三酚。脫羧酶PDC的底物多樣性導(dǎo)致其也會(huì)對(duì)中間產(chǎn)物3,4-二羥基苯甲酸進(jìn)行脫羧反應(yīng),，進(jìn)而生成副產(chǎn)物兒茶酚,。在組裝完整途徑并轉(zhuǎn)化到宿主菌中發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)鄰苯三酚產(chǎn)量很低，副產(chǎn)物兒茶酚產(chǎn)量很高,，說明Y385F/T294A PobA催化3,4-二羥基苯甲酸到?jīng)]食子酸的過程不夠迅速,，導(dǎo)致大量的碳源流向了副產(chǎn)物兒茶酚的生產(chǎn)途徑。于是,，申請(qǐng)人借鑒了CipA的自組裝特性,，將CipA與合成途徑中的關(guān)鍵限速酶Y385F/T294A PobA融合形成融合蛋白（Y385F/T294A PobA-CipA或CipA-Y385F/T294A PobA），隨后融合蛋白在胞內(nèi)聚集形成包涵體（圖3）,。聚集后的Y385F/T294A PobA加快了4-羥基苯甲酸到?jīng)]食子酸的兩步轉(zhuǎn)化,，降低了脫羧酶PDC對(duì)3,4-二羥基苯甲酸的催化，提高了目標(biāo)產(chǎn)物鄰苯三酚的產(chǎn)量,。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Applied Microbiology and Biotechnology （影響因子：5.0002）雜志上（CipA-mediating enzyme self-assembly to enhance the biosynthesis of pyrogallol in Escherichia coli .）。陳振婭副研究員為通訊作者,。
圖3 自組裝聚集Y385F/T294A PobA
3. 基于自組裝支架構(gòu)建新型蛋白純化方法
常用的傳統(tǒng)蛋白分離純化方法是親和純化,，其依賴于對(duì)親和層析柱的使用,。親和純化的成本高，與大規(guī)模生產(chǎn)不適配,，同時(shí)利用親和純化得到的蛋白帶有純化標(biāo)簽,，而純化標(biāo)簽會(huì)影響靶蛋白活性。因此,，為了節(jié)省蛋白純化成本,，簡(jiǎn)化純化步驟，同時(shí)使靶蛋白維持原有特性,，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)開發(fā)了一種自組裝蛋白純化方法,，這種蛋白純化方法依賴于一種雙功能純化標(biāo)簽CipA-DnaB，此標(biāo)簽同時(shí)具有自組裝和自裂解功能,，將此標(biāo)簽與靶蛋白融合即可純化得到無標(biāo)簽靶蛋白,，且靶蛋白能夠保持原有活性。CipA-DnaB標(biāo)簽是由自組裝蛋白CipA和內(nèi)含肽蛋白 Ssp DnaB融合得到,，其中CipA可自發(fā)組裝形成蛋白包涵體,， Ssp DnaB是一種在弱酸條件下C端可發(fā)生自裂解的短內(nèi)含肽。將此雙功能標(biāo)簽與靶蛋白融合后,，靶蛋白會(huì)在CipA的引導(dǎo)下進(jìn)行自組裝（圖4）,，隨后僅需離心和自裂解步驟即可快速純化得到可溶的無標(biāo)簽靶蛋白。接著,，為了提高蛋白純化效率,，優(yōu)化了CipA與 Ssp DnaB之間的連接肽和自裂解條件，結(jié)果顯示利用柔性連接肽同時(shí)在裂解液中添加EDTA能夠顯著提高蛋白純化效率,。為了驗(yàn)證此自組裝蛋白純化方法的普適性,，利用此方法純化了MBP、KivD和AdhP,，同時(shí)檢測(cè)了純化后的KivD和AdhP酶活性,，結(jié)果顯示純化后的KivD和AdhP仍然具有較高的比酶活。此項(xiàng)工作建立的新型自組裝純化方法可為工業(yè)蛋白純化提供一種成本低且有效的選擇,。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Journal of Biotechnology （影響因子：4.0998）雜志上,。（A novel protein purification strategy mediated by the combination of CipA and Ssp DnaB intein.）副研究員陳振婭與碩士生趙璐瑤為共同第一作者，霍毅欣教授與陳振婭副研究員為共同通訊作者,。
圖4 CipA-DnaB在大腸桿菌中組裝eGFP
該項(xiàng)工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金的支持，也感謝北京理工大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程公共實(shí)驗(yàn)中心的支持,。
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